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Metabolitenanalyse mittels GC-MS

Unabhängig von der Art des zu untersuchenden Organismus ist die Zahl der intrazellulären Metabolite im Vergleich zu den extrazellulären weitaus größer. Eine direkte Identifizierung und Quantifizierung der Metaboliten mittels 1H-NMR-Spektroskopie ist deshalb meist nicht möglich. Zum einen kommt es zu einer Überlagerung der Protonensignale verschiedener Metabolite, so dass eine eindeutige Identifizierung erschwert wird, zum anderen ist die Konzentration vieler Metabolite zu gering, um mittels NMR-spektroskopischer Verfahren erfasst zu werden. Die Methode der Wahl ist in diesem Fall aufgrund ihrer hohen Trennleistung und des hohen Informationsgehaltes der erhaltenen Massenspektren die GC-MS.

Mit der von uns angewendeten Methode ist es derzeit möglich, ca. 200 verschiedene Metabolite zu trennen und zu qualifizieren. Eine relative Quantifizierung ist über interne Standards möglich und liefert Aussagen über die Änderung der Metabolitenverhältnisse in verschiedenen Proben. Für die direkte Quantifizierung einzelner Metabolite ist die Aufnahme von Kalibrationskurven erforderlich. Etabliert ist diese Quantifizierung bereits für alle proteinogenen Aminosäuren und für ca. 50 andere Metabolite aus den Bereichen organische Säuren, nichtproteinogene Aminosäuren, Kohlenhydrate und Fettsäuren.

 

 

 

 

 

 

Da die meisten Metabolite für eine direkte Trennung mittels Gaschromatographie zu polar sind, muss der eigentlichen Trennung ein Derivatisierungsschritt vorgeschaltet werden, in dem eine Silylierung der polaren funktionellen Gruppen der Metabolite erfolgt.

 

 

Probenmenge

Probenmenge: ca. 100 mg Feuchtmasse an Zellen.

Metabolitenkonzentration: im Bereich nanomolar bis picomolar

 

 

Probenbeschaffenheit

Die folgenden Kriterien müssen erfüllt sein:

  • Quantitativer und reproduzierbarer Zellaufschluss
  • Zusatz eines internen Standards zur Aufschlusskontrolle und späteren relativen Quantifizierung
  • Lyophilisation der aufgeschlossenen Proben zur Bestimmung der Trockenmasse und als Voraussetzung für die vorgeschaltete Derivatisierung

 

 

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